Kromatografi är en av metoderna för att separera ämnen. Den används för efterföljande kvalitativ och kvantitativ analys av de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos mikropartiklar. En variant av denna teknologi är affinitetskromatografi. Idén om att differentiera proteinföreningar med hjälp av egenskapen molekylär affinitet har varit känd inom vetenskapen i flera decennier. Det har dock fått sin utveckling först under de senaste åren, efter introduktionen av mycket porösa hydrofila material som används som matris. Denna metod gör det möjligt att lösa både analytiska problem (separering av ämnen och deras identifiering) och preparativa problem (rening, koncentration).
Essence
Affinitetskromatografi (från det latinska ordet affinis - "angränsande", "relaterad") är baserad på affinitetsinteraktioner, som är bildningen av mycket specifika bindningar mellan en spacermolekyl (ligand eller affinant) och en målmolekyl. Dessa mekanismer är utbredda i naturen (koppling av mediatorer eller hormoner och receptorer, antikroppar ochantigener, hybridisering av polynukleotider och andra typer av processer). Inom medicin har affinitetskromatografi använts i praktiska syften sedan 1951
Komponenterna är separerade enligt följande:
- arbetslösning som innehåller ämnet som ska isoleras leds genom sorbenten;
- ligand avsatt på sorbentmatrisen behåller denna substans;
- det är koncentrerat (ackumulering);
- extraktion av det isolerade ämnet från sorbenten genom att tvätta med ett lösningsmedel.
Med den här metoden kan du isolera hela celler. Skillnaden från traditionell sorptionskromatografi är att det finns en stark biospecifik bindning av den isolerade komponenten till sorbenten, vilket kännetecknas av hög selektivitet.
Adsorbenter
Följande ämnen används som adsorbenter:
- Gelföreningar baserade på agaros, en polysackarid erhållen från agar. De mest använda är 3 varianter: sepharose 4B, CL (tvärbunden agaros) och affi-gel. Den senare kompositionen är en modifierad gel av agaros och polyakrylamid. Den har större biologisk tröghet, hög kemisk och termisk beständighet.
- Silica (kiselgel).
- Glass.
- Organiska polymerer.
För att eliminera mekaniska hinder under ligandkontakt används ytterligare ämnen för att separera den från bäraren (peptider, diaminer, polyaminer, oligosackarider).
Utrustning
Affinitetskromatografiutrustning inkluderar följande huvudenheter:
- lagringstankar för den mobila fasen (eluent);
- högtryckspumpar för medeltillförsel (oftast fram- och återgående);
- filter för rengöring av eluenter från damm;
- doseringsenhet;
- kromatografisk kolumn för blandningsseparering;
- detektor för att detektera separerade komponenter som lämnar kolumnen;
- kromatogramskrivare och mikroprocessorenhet (dator).
För att minska mängden löst luft leds först helium genom den mobila fasen. För att ändra koncentrationen av eluenten installeras flera pumpar som styrs av programmeraren. Kromatografiska kolonner är gjorda av rostfritt stål (för ökade krav på korrosionsbeständighet), glas (univers altillval) eller akryl. I förberedande syfte kan deras diameter variera från 2 till 70 cm. Vid analytisk kromatografi används mikrokolonner Ø10-150 µm.
För att öka detektorernas känslighet införs reagenser i blandningen, som bidrar till bildningen av ämnen som absorberar mer strålar i det ultravioletta eller synliga området av spektrumet.
Methodology
Det finns två huvudtyper av vätskeaffinitetskromatografi:
- Kolonn, i vilken kolonnen är fylld med en stationär fas och en blandning leds genom den med ett flödeelueringsmedel. Separation kan ske under tryck eller under gravitation.
- Tunnt lager. Eluenten rör sig längs det platta adsorbentskiktet under inverkan av kapillärkrafter. Adsorbenten appliceras på en glasplatta, keramik eller kvartsstav, metallfolie.
De viktigaste stadierna av arbetet inkluderar:
- beredning av adsorbenten, fixering av liganden på bäraren;
- matning av separationsblandningen till den kromatografiska kolonnen;
- mobilfasladdning, komponentbindning med ligand;
- fasersättning för att isolera den bundna substansen.
Destination
Affinitetskromatografi används för att isolera följande typer av ämnen (typ av ligand som används anges inom parentes):
- analoger av enzymatiska inhibitorer, substrat och kofaktorer (enzymer);
- bioorganiska ämnen med tecken på genetisk främlingskap, virus och celler (antikroppar);
- kolhydrater med hög molekylvikt, monosackaridpolymerer, glykoproteiner (lektiner);
- nukleära proteiner, nukleotidyltransferaser (nukleinsyror);
- receptorer, transportproteiner (vitaminer, hormoner);
- proteiner som interagerar med cellmembran (celler).
Denna teknik används också för att erhålla immobiliserade enzymer, och bindning av dem till cellulosa möjliggör produktion av immunosorbenter.
kromatografi av DNA-bindande proteiner
Isolering av DNA-bindande proteiner utförs med hjälp avheparin. Denna glykosaminoglykan kan binda ett brett spektrum av molekyler. Affinitetskromatografi av proteiner i denna grupp används för att isolera ämnen som:
- faktorer för initiering och förlängning av translation (syntes av nukleinsyramolekyler och proteiner);
- restriktaser (enzymer som känner igen vissa sekvenser i dubbelsträngat DNA);
- DNA-ligaser och polymeraser (enzymer som katalyserar sammanfogningen av två molekyler för att bilda en ny kemisk bindning och är involverade i DNA-replikation);
- serinproteashämmare som spelar en viktig roll i immunförsvar och inflammatoriska processer;
- tillväxtfaktorer: fibroblast, Schwann, endotelial;
- proteiner av extracellulär matris;
- hormonreceptorer;
- lipoproteiner.
Dignity
Denna metod är en av de mest specifika för isolering av reaktiva föreningar (enzymer och större aggregat - virus). Det används dock inte bara för att isolera biologiskt aktiva ämnen.
Detektion av antikroppar i små mängder, kvantitativ bedömning av polyadenylsyra, snabb bestämning av molekylmassorna av dehydrogenaser, avlägsnande av vissa föroreningar, studie av kinetiken för aktivering av den inaktiva formen av trypsin, den molekylära strukturen hos människan interferoner - detta är inte hela listan över studier där affinitet används kromatografi. Användningen i kliniken beror på dess fördelar som:
- Effektiv rengöringsförmågaproteiner, polysackarider, nukleinsyror. De skiljer sig något i sina fysikaliska och kemiska egenskaper och förlorar aktivitet under hydrolys, denaturering och andra typer av behandling som används i andra metoder.
- Hastigheten för separation av ämnen, processens dynamiska natur.
- Inget behov av speciell enzymrening och isoenzymhomogenisering för att bestämma dissociationskonstanter.
- Kan separera ett brett spektrum av ämnen.
- Låg förbrukning av ligander.
- Möjlighet att separera ämnen i stora volymer.
- Reversibel process för att binda biologiska makromolekyler.
Denna teknik kan kombineras med andra för att skapa ett extra fält (gravitationellt, elektromagnetiskt). Detta låter dig utöka den tekniska kapaciteten för kromatografi.
Enzymatisk ingenjörskonst
Tack vare denna metod började den aktiva utvecklingen av en ny gren av bioteknik - enzymteknik.
Affinitetskromatografi för enzymisolering har följande fördelar:
- att få enzymer i stora mängder som ett resultat av kortare tid, som ett resultat - deras prissänkning;
- immobilisering av enzymer kan avsevärt utöka omfattningen av deras tillämpning inom medicin och industri;
- Associationen av enzymer med ett olösligt fast underlag gör det möjligt att studera påverkan av mikromiljön och riktningen av reaktioner, som spelar en viktig roll i naturliga och fysiologiska processer.
