PCR, eller polymeraskedjereaktion, är en sofistikerad laboratorieteknik som används flitigt inom medicin och andra vetenskapliga områden. PCR-diagnostik blev vid en tidpunkt ett verkligt genombrott inom vetenskapen.
Description
Kvantitativ PCR är en typ av re altids-PCR.
Detta förstås som en variant av PCR, där reaktionens kinetik ständigt registreras, vilket gör det möjligt att kvalitativt utvärdera innehållet av specifika DNA-nukleotidsekvenser i en komplex molekylblandning.
Kvantitativ PCR-metod kommer att diskuteras mer i detalj nedan.
Käran i analysen
Kulturella och serologiska metoder används särskilt ofta för att diagnostisera infektioner. Under den första bestäms antikroppar mot en smittsam patogen i blodserumet. I den andra används biologiskt material som tagits från en sjuk person för att så ett specifikt medium som är gynnsamt för tillväxten av patogenkolonier. Diagnostik i bådaärendet kan pågå i dagar eller veckor.
PCR-undersökning kan utföras med olika biologiska material som erhålls från en sjuk person. Blod och andra patologiska, fysiologiska och biologiska medier och vätskor fungerar som prover. Du kan göra PCR-avföring eller urin.
Atypiska och virala infektioner diagnostiseras oftast med kvantitativ PCR, eftersom de kanske inte är lätta att diagnostisera på grund av den specifika karaktären hos den patologiska process som de provocerar fram. För att bestämma sådana infektioner tar det tid, under vilken antikroppar börjar produceras i kroppen, bestämt med serologiska metoder. Men detta är oacceptabelt i vissa fall.
Utförandemetod
PCR-metod - laboratoriedetektering av infektion i prover isolerade från patienten (in vitro).
För att utföra en polymeraskedjereaktion krävs en uppsättning speciella reagenser.
Testmaterialet införs i provrör med reagens. Provrören placeras i en speciell apparat - en PCR-förstärkare, som är utformad för att amplifiera (öka antalet) av de önskade RNA- eller DNA-fragmenten, PCR-förstärkaren fungerar i ett cykliskt läge. I vilken cykel som helst, om proverna innehåller RNA- eller DNA-sekvensen för patogenen, ackumuleras fler och fler kopior av partiklarna av dessa nukleinsyror i lösningen. Du kan fastställa förekomsten av patogenen och dess mängd i proverna.
Typer av PCR
Kvalitativ analys av PCR låter dig få följande resultat:
- negativ när patogenen av intresse inte hittas i proverna;
- positiv om sekvenser finns i proverna som är karakteristiska för en viss patogen.
Med ett positivt PCR-resultat kan vi tala med 95 % noggrannhet om förekomsten av en diagnostiserad infektion. Samtidigt når noggrannheten för PCR-uppsättningar som används för diagnostiska ändamål 100%.
Vanligtvis bestäms 5 % av felaktiga resultat av den mänskliga faktorn. Till exempel kan brott mot tekniken för analys och lagring av reagenser avsevärt minska studiens noggrannhet.
Kvantitativ PCR definierar begreppet viral belastning. Det är möjligt att fastställa hur många uppsättningar patogen-DNA som fanns i proverna som togs från patienten.
Infektionens svårighetsgrad är direkt proportionell mot ökningen av antalet. Du kan också avgöra hur framgångsrik behandlingen är för att minska virusmängden.
Inlämning av PCR-biomaterial
Kvantitativ PCR utförs på kliniken, främst på morgonen. Under ett besök hos läkaren kommer patienten att få veta vad som måste tas: skrapning, utstryk, urin eller blod. PCR kan detektera patogener oavsett graden av kontaminering av materialet.
För en positiv analys krävs i teorin närvaron av endast en patogen i proverna. I praktiken försöker man skapa ännu gynnsammare förutsättningar. Det finns några rekommendationer för detta:
- om de tar en skrapning eller en svabb från könsorganenorgan måste du avstå från intimt samlag tre dagar före studien;
- du kan inte skölja med antibakteriella läkemedel eller tvätta dig innan analysen;
- tre timmar innan du tar ett utstryk från urinröret måste du ha tålamod och inte tömma tarmarna.
Följ inte dessa regler när du donerar blod.
Hur tolkas resultaten av kvantitativ PCR-analys?
Kvantitativ utvärdering av de erhållna resultaten
I ett antal kliniska situationer uppstår problemet med behandlingens effektivitet och/eller dynamiken i den patologiska processen. Sådana frågor är särskilt relevanta när man undersöker personer med kroniska infektioner (humant immunbristvirus, hepatit B och C). Vid diagnostisering baseras de på det faktum att ackumuleringen av amplikoner (PCR-produkter) är proportionell mot förekomsten av kopior av den önskade genen i det analyserade provet.
Naturligtvis, med hänsyn till resultaten av kvantitativ PCR görs genom gelelektrofores med studier av intensiteten hos speciella PCR-signaler. En förutsättning för en korrekt kvantitativ bedömning av de erhållna resultaten är också positiva tillförlitliga kontrollprover som innehåller ett känt antal kopior av den önskade genen (till exempel tusen kopior av hepatit C-genen för en PCR-reaktion). Flera serieutspädningar av den kvantitativa kontrollen gör att kalibreringskurvor kan genereras och används för att utvärdera innehållet i kliniska genokopier i kliniska prover.
I definitionen av kvantitativ PCR har en nyckelprestation varit skapandetfluorescerande DNA-sonder som läggs till reaktionsblandningen samtidigt med enkla primers och låter dig spåra PCR-processen i tid, det vill säga re altids-PCR.
TaqMan-metoden hänvisar till syntesen av fluorescerande DNA-sonder som är specifika för den mellersta delen av amplikonet och har två märkningar i ändarna. En av dem är en fluorescerande märkning, den andra är en quencher-molekyl för denna fluorescens.
En speciell enhet, som är en hybrid av en fluorimeter och en termoblock-förstärkare, gör konstanta mätningar av fluorescens i varje provrör (re altids-PCR-princip). Efter 20-40 cykler av PCR kommer individuella kurvor att erhållas för varje prov. Antalet kopior av den önskade genen som finns i testprovet kan beräknas från kalibreringskurvor med kontrollprover.
En viktig egenskap för implementeringen av PCR med fluorescerande metoden är också att det inte finns något behov av att öppna rör med en PCR-blandning när man tar hänsyn till resultaten. Detta minskar möjligheten för rumskontamination med förstärkningsprodukter och det finns inget behov av att tilldela särskilda arbetsområden för elektrofores.
Vad visar en kvantitativ PCR-transkription?
Vad upptäcks?
Genom en metod som kvantitativ PCR hittas kvalitativa förändringar i gener: insertioner, deletioner och punktmutationer. Men med vissa ärftliga sjukdomar uppträder motsvarande symtom som svar på en förändring i innehållet i vissa gener.
TackKvantitativ analys ger ett numeriskt resultat, oftast i IE / ml. Det betyder att i en milliliter av testprovet hittades ett visst antal kopior av patogenens RNA eller DNA, mätt i internationella enheter.
Beroende på omfattningen diagnostiseras infektionens svårighetsgrad. Blod testas vanligtvis för att fastställa virusmängden, eftersom virus rör sig fritt i blodet under sjukdom.
Funktioner
Kvantitativ PCR i ett blodprov har två funktioner.
- Analysen utförs i närvaro av primers eller deoxiribonukleosidtrifosfater, som är märkta med en fluorescerande eller radioaktiv märkning för att exakt bestämma innehållet i den bildade PCR-produkten.
- I PCR-processen, avsluta reaktionen tidigt innan för många PCR-produkter dyker upp. Detta beror på det faktum att i slutskedet av mättnad, när det finns många PCR-produkter, fungerar både enzymet och substraten som de begränsande länkarna för denna reaktion. Slutet av nästa PCR-cykel under sådana förhållanden kännetecknas inte längre av en fördubbling av antalet PCR-produkter, obetydliga kvantitativa skillnader mellan olika prover utjämnas, vilka är ganska tydligt definierade i de tidiga stadierna efter att ha passerat en serie reaktionscykler.
Kostnad för PCR-diagnostik
PCR-forskning har en kostnad, som beror på vilken typ av infektion som ska testas, på analysmetodiken och testmaterialet. För att fastställa en infektion måste du ge inom200-800 rubel. En avgift för att ta biomaterial tillkommer också - cirka 400 rubel.
