Flödescytometri är en cytologisk forskningsmetod som används för djupgående analys av celler. Dess fördel är att den låter dig studera varje cell individuellt. Denna typ av analys hjälper till att utvärdera flera parametrar i hundratals celler på några sekunder. Som ett resultat av detta anses cytofluorimetri vara en av de snabbaste och mest exakta analysmetoderna som för närvarande är tillgängliga för forskare och kliniker.
Princip
Flödescytometrins princip är baserad på mätning av ljusspridning och luminescens (fluorescens) hos celler. Cellsuspensionen leds som en ström med hög hastighet genom cytometercellen, där den bestrålas med laser. Där utförs också den så kallade hydrodynamiska fokuseringen. Dess mekanism är att flödet från cellen med de studerade partiklarna vid utloppet strömmar in i den yttre strålen, som har en högre hastighet. Som ett resultat är partiklarna inriktade i en ordnad kedja.
Förceller är märkta med speciella fluorescerande färgämnen (fluorokromer). Tack vare dem, laserstrålenframkallar en sekundär glöd. De mottagna ljussignalerna registreras av detektorer. Därefter bearbetas informationen med hjälp av mjukvarualgoritmer som låter dig räkna individuella cellpopulationer som skiljer sig åt i vissa kriterier.
Forskning med konventionell mikroskopi misslyckas ofta med att skilja mellan olika celler eftersom de ser likadana ut. Cytofluorimetri kan tillhandahålla andra data (DNA-strukturintegritet), analysera proteinuttryck, cellöverlevnad.
Eftersom excitation av fluorokromer kräver ljusstrålar med olika våglängder, samt olika typer av detektorer, är moderna installationer utrustade med flera detektionskanaler (från 4 till 30). Antalet lasersändare kan vara från 1 till 7. Mer komplexa enheter tillåter multiparameterstudier av flera egenskaper hos partiklar samtidigt.
Fördelar och nackdelar
Fördelarna med flödescytometri inkluderar:
- hög bearbetningshastighet (registrering av upp till 30 tusen händelser på 1 sekund);
- möjlighet att studera ett stort antal celler (upp till 100 miljoner i ett prov);
- Kvantifiera intensiteten av fluorescerande ljus;
- analys av varje cell;
- samtidig studie av heterogena processer;
- automatisk separation av data efter cellpopulationer;
- kvalitetsvisualisering av resultat.
En annan egenskap hos den här tekniken är detden analyserade partikeln kan färgas med flera fluorescerande lösningar. Tack vare detta sker en multiparameterstudie.
Nackdelarna inkluderar komplexiteten hos den tekniska utrustningen och behovet av speciell provberedning.
Cytometrar
De första enheterna av denna typ dök upp redan 1968 i Tyskland, men de blev utbredda långt senare. För närvarande kan alla enheter som fungerar med metoden för flödescytometri delas in i två typer:
- enheter som mäter fluorescerande strålning (två eller fler våglängder), 10° och 90° ljusspridning (lågvinkel- och sidospridningsdetektor);
- enheter som, förutom att mäta flera cellulära parametrar, automatiskt sorterar i grupper enligt dessa kriterier.
Framåtspridningsdetektorn är utformad för att bestämma storleken på cellen, och sidospridningsanordningen låter dig få information om närvaron av intracellulära granuler, volymförhållandet mellan cytoplasman och kärnan.
Klassiska cytometrar, till skillnad från ljusmikroskop, tillåter inte att få en bild av en cell. Men på senare år har kombinerade enheter utvecklats som kan kombinera kapaciteten hos ett mikroskop och en cytofluorimeter. De kommer att diskuteras nedan.
Bildcytometrar
För instrument som används i klassisk flödescytometri,en egenskap är karakteristisk: om sällsynta händelser registreras i populationen av analyserade celler, så finns det inget sätt att bedöma vad deras väsen är. Dessa partiklar kan antingen vara rester av döda celler eller en sällsynt grupp av dem. I konventionella enheter utesluts sådana data från det allmänna flödet av händelser, men det är de som kan vara av särskilt värde för vetenskaplig och klinisk analys.
Den nya generationen av avbildningsflödescytometrar låter dig ta en bild av varje cell som passerar i flödet genom detektorzonen. Det är lätt att se det genom att klicka på motsvarande område i diagrammet, som visas på datorskärmen.
Användningsområden
Flödescytometri är en universell metod som används inom många områden av medicin och vetenskap:
- immunologi;
- onkologi;
- transplantologi (transplantation av röd benmärg, stamceller);
- hematology;
- toxicology;
- biokemi (mätning av surhet inuti cellen, studie av andra parametrar);
- farmakologi (skapa nya läkemedel);
- mikrobiologi;
- parasitologi och virologi;
- oceanologi (studien av växtplankton för att bedöma tillståndet för vattenförekomster och andra uppgifter);
- nanoteknik och mikropartikelanalys.
Immunologi
Det mänskliga immunförsvaret består av en mängd olika celler. Flödescytometri i immunologi gör det möjligt att utvärdera deras struktur och funktioner, det vill säga att utföra morfofunktionellaanalys.
Sådan forskning hjälper till att förstå immunitetens komplexa natur. Cellfenotyper förändras som ett resultat av aktivering av antigener, utveckling av patologier och andra faktorer. Cytofluorometri kan separera subpopulationer av immunceller i en komplex blandning och utvärdera alla deras förändringar över tiden.
Onkologi
En av de viktigaste uppgifterna inom onkologi är differentieringen av celler efter deras typ. Principen för analys med flödescytometri i onkohematologi är baserad på följande fenomen: när ett prov behandlas med ett speciellt fluorescerande färgämne, binder det till cytoplasmatiska proteiner. Efter delning i aktivt prolifererande celler minskar dess innehåll med hälften. Följaktligen minskar cellluminescensens intensitet dubbelt.
Det finns andra sätt att upptäcka prolifererande celler:
- användning av DNA-bindande färgämnen (propidiumjodid);
- användning av märkt uracil;
- registrering av en ökad expressionsnivå av cyklinproteiner, som är involverade i regleringen av cellcykeln.
